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饲料中呕吐毒素的危害和生物脱毒方法研究进展
文章来源:深芬仪器    时间:2018-06-13 19:31:49   

呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON) 是谷物中最为常见的一种真菌毒素, 其降低畜禽的生产性能, 并且对动物免疫系统、细胞信号传导和基因的表达均有不同程度的影响。随着我国灾害气候的频频发生, 呕吐毒素的污染程度呈现加剧趋势, 因此呕吐毒素污染的控制迫在眉睫。传统控制脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法主要有物理法和化学法, 但上述两种方法都具有局限性。本文阐述了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化学性质、毒性作用以及生物脱毒方面的研究进展,为研究生物学方法控制粮食与饲料中呕吐毒素含量提供参考。


呕吐毒素是一种单端孢霉烯族毒素,主要由粉红镰刀菌和禾谷镰刀菌产生。其化学名为3α,7α,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮,化学式为C15H20O6,纯品是一种无色针状结晶,可在乙酸乙酯和甲醇中长期保存。低剂量的呕吐毒素,主要引起动物食欲下降、体重减轻、代谢紊乱等症状,大剂量可导致动物呕吐。呕吐毒素对消化系统、血液系统、中枢系统以及钙磷代谢均产生影响,呕吐毒素具有慢性和亚慢性毒性、急性毒性、免疫毒性等多种毒性作用。


1、呕吐毒素的毒性及对动物的危害


动物对呕吐毒素的反应有种属和性别差异,雄性动物对毒素比较敏感,猪比小鼠、家禽和反刍动物更敏感。单端孢霉烯族毒素会引起大部分畜禽呕吐,其中猪最为敏感,是其他动物的100~200 倍。有研究表明,呕吐毒素能够引起猪呕吐的最小口服剂量为0.1~0.2mg/kg,当摄入0.5mg/kg的呕吐毒素后,5~7min 就会引起呕吐。呕吐毒素对机体免疫系统的侵害主要包括对免疫细胞的增殖与凋亡的影响以及对免疫细胞因子的释放这两个方面。呕吐毒素能够诱导机体内免疫球蛋白分泌紊乱,免疫球蛋白是免疫病理结果的一种特征指标,它为呕吐毒素对动物免疫系统的影响提供了一种新的路径,还能够影响机体内肿瘤坏死因子、白细胞介素等的水平。也有研究报道指出,呕吐毒素使小鼠IgA水平显著提高,人类肾小球肾炎、IgA 肾病也出现相似的情况。其作用机理是呕吐毒素能够增加IgA 分泌细胞的数量,这是由于巨噬细胞和T淋巴细胞产生的细胞因子介导的结果。同时有报道指出,如果对小鼠体外培养和小鼠体内白细胞介素-6(IL-6) 缺陷,均可以证明呕吐毒素对IL-6 有着十分重要的诱导作用。Moon 等也证明了体内环氧合酶-2(COX-2)基因的上调是由呕吐毒素诱导的结果,之后产生的前列腺素的一些代谢物对IL-6 的分泌有明显的效果。


2、呕吐毒素污染概况


据统计,每年全球有至少25%的饲料原料被霉菌毒素污染。我国主要霉菌毒素污染是黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、烟曲霉毒素以及呕吐毒素,90%以上的原料显示阳性。国内饲料原料霉菌毒素污染超标率高达60%~70%。呕吐毒素和污染分布也显示了一些关键特征:霉菌污染严重的主要是水稻粮食作物,尤其在谷物丰收后污染最为严重。呕吐毒素对许多作物均可造成污染,其中最为普遍的是谷物类原料,其次是油籽类原料。由于温度、湿度等差异,即使在同一季节,不同地区收获的玉米所带菌属也有较大差异,相比东北地区的呕吐毒素污染,华北地区的部分玉米呕吐毒素的污染较重。


3、饲料中呕吐毒素的脱毒技术


对谷物和饲料进行适当的脱毒处理是控制和减轻霉菌毒素危害的重要方法,研究者们已做了很多关于呕吐毒素脱毒的研究,基本上分为物理、化学和生物脱毒3类。


3.1 物理脱毒法


密度筛选,研磨,使用紫外光、γ- 射线照射以及添加霉菌毒素吸附剂等是常见的物理脱毒方法。呕吐毒素可以溶于水,湿磨碎后污染的谷物中的呕吐毒素会在水中富集,只有少量毒素在淀粉中。油料籽实和谷物的密度筛选方法是基于污染和未污染谷物种子之间的密度差异,应用浮选法将二者重新分流,进而将二者区分开来的方法,从而能够很大程度上降低呕吐毒素的浓度。这种方法很适用于易感染呕吐毒素的玉米和小麦。霉菌毒素吸附剂法是目前应用较广的物理去毒方法,包括黏土、硅藻土、酵母细胞壁提取物、硅铝酸盐、葡甘露聚糖、酯化甘露聚糖等。但大量试验证实霉菌毒素吸附剂只对饲料中的黄曲霉毒素有较好的吸附效果,而对呕吐毒素的吸附率不足5%。


3.2 化学脱毒法


因为毒素在强酸、强碱或强氧化剂的作用下转化为无毒物质的原理,所以化学脱毒法根据化学试剂的不同而方法较多。酸处理法、碱处理法、氨处理法及有机溶剂处理法是常见的化学脱毒法。向受到呕吐毒素污染的粮食或饲料中通入液氨,在室温或加热条件下密封储存,在氨的作用下呕吐毒素化学结构发生变化,转化为没有毒性的物质,因而解毒。近年来,有机溶剂萃取法解毒成为研究热点。常用的有机溶剂有95%的乙醇、异丙酮、丙酮、正己烷-甲醇、80%异丙酮、乙腈、甲醇、丙酮-正己烷-水、正己烷-乙醇-水等,利用这些溶剂,几乎可将饲料中所有的呕吐毒素去除。


3.3 生物脱毒法


目前,有关呕吐毒素生物降解的研究在国内外正成为热点。使用特定的微生物或其产生的酶来降解发霉饲料中的霉菌毒素,将这些微生物加入饲料中,实现霉菌毒素的温和降解,避免强酸、强碱、高温对饲料的营养物质造成破坏,达到去除霉菌毒素的目的。该过程不需要引入有毒和有害化学物质,而且还可以减少饲料中的营养物质的损失。生物脱毒法根据其物质和作用机制的不同可分为生物降解法、生物吸附法、转基因技术消除法及其他的一些生物处理方法,许多微生物如酵母菌、细菌、真菌等可以去除或减少食品和饲料中的霉菌毒素。


3.3.1 生物吸附法


目前畜禽生产中应用最为广泛的毒素脱毒方法是在饲料中添加毒素吸附剂。在动物体内吸附剂与毒素结合形成复合体,在毒素经过消化道时不被动物体吸收并随吸附剂排出体外,从而降低毒素的生物学效应,减少血液中毒素浓度和肠道对毒素的吸收,并且减少靶器官中毒素含量。相比传统的物理吸附方法,微生物菌体吸附法具有反应条件温和、吸附过程不会造成饲料中营养物质流失等优点。目前,研究发现,真菌类和乳酸菌类是主要的对呕吐毒素具有吸附作用的菌株。同时研究发现美极梅奇酵母、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、发酵地霉酵母4种酵母对呕吐毒素也具有良好的吸附效果。而DON可被丝状真菌米曲霉和米根霉吸收到菌丝体上,通过深层发酵降解呕吐毒素,在48 h 后降解速率达到最大。Oliveira 等培养的罗伊乳酸菌R29 的发酵液可以抑制镰刀菌孢子萌发,进而减少呕吐毒素的积累。El-Nezami 等研究发现,20 μg/mL 的呕吐毒素与鼠李属乳酸菌株LGG、LC-705 及费氏丙酸杆菌3株菌株共同培养1h 后,上清液中64%~93%的呕吐毒素被吸附,且灭活细胞与活细胞对呕吐毒素的吸附能力没有差异(P>0.05)。


微生物吸收呕吐毒素的原理主要与葡甘露聚糖在细胞壁上的吸附有关。目前,从真菌细胞壁提取的葡甘露聚糖的解毒剂已广泛应用于饲料行业。发现作为霉菌毒素吸附剂,高分子量葡甘露聚糖不仅可吸附呕吐毒素,而且可以调节肉仔鸡的免疫功能。微生物菌体细胞壁对呕吐毒素吸附是可逆性的,呕吐毒素的吸附作用与细菌的种类及浓度有关,因此需要进一步改善吸附剂的质量和稳定性。


3.3.2 生物降解法


生物降解由于其有效性、环保性和针对性,将成为未来霉菌毒素解毒的一种趋势。酶解脱毒是通过使用酶或活细菌(产脱毒酶) 将毒素转化为无毒物质来改变毒素结构以控制饲料中霉菌毒素风险的有效途径。


呕吐毒素的主要毒性基团是C-12,13 环氧环和C3-OH 基团,可引起毒性与核糖体结合,造成核糖体毒性压力效应,许多调节基因表达的蛋白激酶被活化,抑制蛋白合成并产生细胞毒性,这3 个基团是呕吐毒素生物降解研究的主要位点。呕吐毒素的生物降解包括毒素分子的羟化、水解、去环氧化、脱乙酰和糖苷化,微生物通过在DON 中释放胞外酶,并作用于DON 将其转化为低毒的化合物。


⑴C3- OH 氧化和差向异构化


微生物可以将呕吐毒素结构中的3- OH 基团氧化成3- 酮基,产生3- 酮基- DON,或形成可以解毒的同分异构体3- epi- DON。沃斯特氏菌属和诺卡氏菌属和其他好氧性细菌可以达到该条降解途径。Volkl 等推测乙醇脱氢酶可以辅助辅酶NADH 或NADPH 将DON 分子的C3- OH 基团氧化成3- 酮基。Shima 等从土壤中筛选出一种土壤杆菌属根瘤菌E3- 39,胞外提取液24 h可将培养基中200 μg/mL 的DON 代谢为3- keto-DON。后续研究推测E3- 39 菌分泌的胞外酶可完成这种转化。计成等筛选的德沃斯氏菌属ANSB714 发酵液(活菌数4.5×109CFU/mL) 与100 mg/mL 的DON 共同培养24 h 后,DON 降解率高达97.34%。在模拟肠道条件下,ANSB714 菌株对霉变小麦和DDGS饲料中DON 降解率分别为86.19%和84.34%。Sato等采用高效液相色谱法详细比较了德沃斯氏菌属及诺卡氏菌属对DON 降解途径的不同,为探究DON 降解机制提供了理论基础。


⑵C12/C13 开环氧化作用


微生物可将呕吐毒素结构中的C12/C13 环氧基团水解成两个相邻的羟基,生成转化产物DOM- 1,达到解毒作用。这些微生物主要由瘤胃、肠道厌氧菌群及芽胞杆菌组成。Fuchs 等从牛瘤胃中分离到一株厌氧优杆菌属细菌BBSH797,该菌可将呕吐毒素代谢成单一产物DOM- 1。近年来,研究人员陆续筛选出多种具有将呕吐毒素降解为DOM- 1 的菌株。Li 等研究表明芽孢杆菌LS100 可将呕吐毒素转化成DOM- 1,并通过仔猪饲喂实验发现降解产物DOM- 1 不会对猪产生负面影响。Guan 等从褐色大头鲶(Ameiurus nebulosus) 肠道中分离到微生物混合物C133,该混合物只有在完全培养基中才具有将呕吐毒素转变为DOM- 1 的能力。Islam 等从土壤中分离的肠杆菌菌群在有氧条件下可将呕吐毒素深度氧化成DOM- 1,在144 h 内呕吐毒素降解率高达99%。Yu 等采用变性梯度凝胶电泳方法从鸡肠道中分离出10 株可将呕吐毒素转化为DOM- 1 的菌株,为筛选具有该条生物转化途径的菌株提供了有效方法。冯培生等研究发现大鼠肠道微生物可将呕吐毒素代谢生成DOM- 1,随后运用超高效液相色谱串联四极杆- 飞行时间质谱技术分析呕吐毒素代谢产物的碎片离子质荷比变化,据此推测呕吐毒素的降解途径。


⑶其他降解途径


除了上述主要的降解途径外,推测呕吐毒素还存在其他可能的降解途径。研究表明,呕吐毒素中C15 去掉—CH2O,形成分子质量为265 的中间产物,在此基础上,C5 和C6 同时去掉一个CH2O 和一个H2O,形成产物分子质量为247,C6 和C7 在247 的基础上去掉一个H2O,形成分子质量为227 的终产物,产物247 降解的另一种方式为C14 去掉—CH3,C7 去掉—OH,C3 和C4 形成双键的终产物217。呕吐毒素中O1 和C11 间断裂,通过水合作用水解后均变为- OH,研究推测分离得到的塔宾曲霉NJA-1 是通过水合作用的方式降解呕吐毒素,呕吐毒素中C8 位的酮基也容易受到亲核基团的攻击变为羟基,并从化学角度分析,C8 位的O 原子可能被水解,变成2 个- OH。总之,明确DON 的降解和转化途径,可为实际应用中呕吐毒素的清除提供可靠的理论依据。


4展望


与物理和化学方法相比,生物处理对饲料营养成分的影响不大,但由于成本高、效果不稳定,限制了该方法的广泛应用。研究呕吐毒素的生物降解还有很多问题需要解决,如无法定性呕吐毒素解毒酶的解毒效率、生物发酵法生产的解毒酶的活性不高等。目前,呕吐毒素降解酶的研究主要集中在解毒酶的分离和纯化上,以及寻找产解毒酶基因,然后将靶基因克隆到生物表达器中高效表达,将是未来一段时间内霉菌毒素生物降解的研究方向。

 

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